負(fù)責(zé)人

楊倩

儀器生產(chǎn)廠(chǎng)家及型號(hào)

Revvity/Operetta CLS

儀器研究方向

類(lèi)器官研究、毒理實(shí)驗(yàn)

儀器主要功能用途及參數(shù)

核心功能： 首先利用自動(dòng)化熒光顯微成像系統(tǒng)對(duì)培養(yǎng)于多孔板中的細(xì)胞或組織樣品進(jìn)行快速、高分辨率的多通道圖像采集；然后通過(guò)專(zhuān)用的圖像分析軟件，對(duì)獲取的海量圖像進(jìn)行單細(xì)胞水平的定量分析，通過(guò)測(cè)量細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量、熒光強(qiáng)度及蛋白定位等數(shù)十種參數(shù)，來(lái)精確解析復(fù)雜的細(xì)胞表型與功能。

主要用途： 應(yīng)用于細(xì)胞水平的定性觀(guān)察與精確定量統(tǒng)計(jì)分析。具體包括藥物篩選（藥效與毒性評(píng)估）、基礎(chǔ)細(xì)胞生物學(xué)（細(xì)胞周期、凋亡、自噬等信號(hào)通路研究）、癌癥生物學(xué)（腫瘤球與類(lèi)器官分析）、免疫學(xué)（宿主-病原體相互作用）、神經(jīng)科學(xué)（神經(jīng)元形態(tài)分析）及干細(xì)胞研究（分化與重編程）等前沿領(lǐng)域。

核心參數(shù)：

成像模式： 具備寬場(chǎng)、明場(chǎng)、轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦及無(wú)標(biāo)記成像四種模式。

核心硬件： 配備高靈敏度sCMOS相機(jī)、8色LED固態(tài)光源，及最高63倍的高數(shù)值孔徑水鏡。

三維能力： 具備Z軸層掃及專(zhuān)業(yè)的3D圖像重建與定量分析功能，可計(jì)算類(lèi)器官的體積、厚度等參數(shù)。

活細(xì)胞支持： 集成培養(yǎng)箱式活細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，并配備全自動(dòng)水鏡補(bǔ)水系統(tǒng)，支持長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)觀(guān)測(cè)。

智能分析： 軟件具備AI自學(xué)習(xí)細(xì)胞分類(lèi)功能，并集成高級(jí)多維圖像分析模塊（如Imaris）。

測(cè)試內(nèi)容及領(lǐng)域

核心測(cè)試內(nèi)容：在細(xì)胞與亞細(xì)胞水平上，對(duì)多種生物學(xué)表型和功能進(jìn)行高通量、多參數(shù)的定性與定量分析。

常見(jiàn)測(cè)試類(lèi)型和項(xiàng)目：

細(xì)胞表型定量分析：對(duì)細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量、大小、強(qiáng)度等數(shù)十種參數(shù)進(jìn)行自動(dòng)化定量統(tǒng)計(jì)。

細(xì)胞功能與活性檢測(cè)：分析細(xì)胞增殖、凋亡、自噬、細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等關(guān)鍵生命活動(dòng)。

復(fù)雜結(jié)構(gòu)與相互作用研究：解析3D微球/類(lèi)器官結(jié)構(gòu)、神經(jīng)突觸連接、蛋白質(zhì)共定位等。

主要應(yīng)用領(lǐng)域

藥物研發(fā)與篩選：高通量藥物篩選、藥物作用機(jī)制（MOA）研究、細(xì)胞毒性評(píng)估、抗體藥物內(nèi)化分析。

腫瘤生物學(xué)研究：腫瘤細(xì)胞增殖與遷移、3D腫瘤球藥物滲透與療效評(píng)估、腫瘤異質(zhì)性分析。

免疫學(xué)與感染學(xué)： 宿主-病原體相互作用、免疫細(xì)胞吞噬與殺傷功能分析、疫苗研發(fā)佐證。

干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)： 干細(xì)胞多能性鑒定、定向分化過(guò)程監(jiān)測(cè)、類(lèi)器官形成與表型分析。

神經(jīng)科學(xué)：神經(jīng)元形態(tài)與復(fù)雜度分析、神經(jīng)突觸生長(zhǎng)與退行性病變研究、神經(jīng)毒性評(píng)估。

注意事項(xiàng)（儀器使用和樣品制備）

一、儀器預(yù)約與使用

1. 操作資格與培訓(xùn)

操作者必須經(jīng)過(guò)設(shè)施管理員的系統(tǒng)性正規(guī)培訓(xùn)，并通過(guò)理論與實(shí)操考核，獲得獨(dú)立操作資格。

2. 提前預(yù)約與溝通

預(yù)約：嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室管理系統(tǒng)提前預(yù)約，并嚴(yán)格遵守時(shí)間安排。

溝通：預(yù)約時(shí)需詳細(xì)說(shuō)明實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵信息，包括細(xì)胞類(lèi)型、培養(yǎng)板規(guī)格、熒光染料/探針?lè)N類(lèi)、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ㄈ缁罴?xì)胞長(zhǎng)時(shí)間成像、3D球掃描、固定細(xì)胞染色等），以便管理員確認(rèn)實(shí)驗(yàn)方案與儀器配置的兼容性。

3. 開(kāi)機(jī)前檢查

環(huán)境系統(tǒng)檢查：確認(rèn)儀器內(nèi)置的CO?氣源壓力充足、溫度控制器工作正常。若進(jìn)行活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，需提前開(kāi)啟系統(tǒng)預(yù)熱與氣體平衡。

核心組件檢查：確認(rèn)物鏡轉(zhuǎn)盤(pán)、濾光片轉(zhuǎn)輪、自動(dòng)進(jìn)樣器等運(yùn)動(dòng)部件運(yùn)行順暢，無(wú)異常聲響。

4. 方法確認(rèn)

嚴(yán)禁隨意修改他人或經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法。上機(jī)前務(wù)必確認(rèn)所調(diào)用成像方法的參數(shù)（如物鏡倍數(shù)、曝光時(shí)間、熒光通道、Z軸層掃設(shè)置、共聚焦模式等）適用于當(dāng)前樣品，避免因激光功率過(guò)高或曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞光漂白或信號(hào)飽和。建議使用自己創(chuàng)建并優(yōu)化保存的方法。

5. 實(shí)時(shí)監(jiān)控與數(shù)據(jù)管理

實(shí)時(shí)監(jiān)控：運(yùn)行實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需密切觀(guān)察圖像質(zhì)量、對(duì)焦穩(wěn)定性、細(xì)胞狀態(tài)（活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)） 等。發(fā)現(xiàn)圖像失焦、信號(hào)異?；蚣?xì)胞形態(tài)劇變等問(wèn)題，應(yīng)立即暫停并查找原因。

數(shù)據(jù)與衛(wèi)生：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，及時(shí)將海量圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移至指定存儲(chǔ)位置進(jìn)行備份和分析。清理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，取走自己的樣品和廢棄物，并用適當(dāng)清潔劑（如70%乙醇）擦拭載物臺(tái)，保持儀器周?chē)h(huán)境整潔。

二、 樣品制備注意事項(xiàng)

1、樣品本身

細(xì)胞狀態(tài)與相容性：確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，無(wú)支原體污染。細(xì)胞種類(lèi)及所使用的培養(yǎng)板、培養(yǎng)基必須與儀器載物臺(tái)、物鏡及活細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)兼容。例如，使用高倍水鏡時(shí)，需確認(rèn)培養(yǎng)板底板符合要求。

濃度與密度適中：細(xì)胞鋪板密度需均勻且適中。密度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞重疊，影響單細(xì)胞分析；密度過(guò)低則統(tǒng)計(jì)顯著性差，且可能影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)與信號(hào)傳遞。

2. 熒光標(biāo)記

探針/染料選擇與兼容性：所選熒光染料或熒光蛋白的激發(fā)/發(fā)射光譜必須與儀器配置的激光器和濾光片波段匹配。避免光譜串色，必要時(shí)進(jìn)行光譜 unmixing。

染色濃度與毒性：優(yōu)化熒光探針的工作濃度。濃度過(guò)高可能導(dǎo)致熒光淬滅或細(xì)胞毒性，影響活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果；濃度過(guò)低則信號(hào)強(qiáng)度不足。對(duì)于多色標(biāo)記，需確認(rèn)不同染料之間無(wú)化學(xué)反應(yīng)干擾。

設(shè)置對(duì)照：必須設(shè)置未染色對(duì)照、單陽(yáng)對(duì)照等，以用于準(zhǔn)確設(shè)定成像參數(shù)和后續(xù)分析的閾值。

3. 潔凈度與無(wú)菌

樣品潔凈度：確保培養(yǎng)板底板外表面潔凈、無(wú)指紋、灰塵、液體或結(jié)晶，以免嚴(yán)重影響圖像質(zhì)量和自動(dòng)對(duì)焦。

無(wú)菌操作：對(duì)于活細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間成像，整個(gè)制備過(guò)程需保持無(wú)菌操作，防止微生物污染導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

4. 前處理過(guò)程

固定與透化：若為固定細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，固定劑（如多聚甲醛）的濃度和作用時(shí)間需優(yōu)化，以充分固定細(xì)胞同時(shí)避免過(guò)度交聯(lián)影響抗原表位。透化劑（如Triton X-100）的使用也需優(yōu)化，以平衡膜通透性與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的保持。

封閉與抗體孵育：使用合適的封閉劑（如BSA）以減少非特異性結(jié)合?？贵w孵育濃度、時(shí)間和溫度需經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，確保信號(hào)特異且強(qiáng)勁。

5. 上機(jī)前準(zhǔn)備

清晰標(biāo)識(shí)：培養(yǎng)板必須有清晰、唯一的標(biāo)識(shí)，并在軟件序列設(shè)置中準(zhǔn)確記錄板架號(hào)和實(shí)驗(yàn)組別，防止數(shù)據(jù)混淆。

板蓋密封：對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，需使用透氣的密封膜，既防止蒸發(fā)和污染，又保證氣體交換。對(duì)于固定細(xì)胞樣品，可密封板蓋以防溶液揮發(fā)。

主要配件及拓展功能

數(shù)據(jù)分析工作站（多維圖像分析工作站）

儀器操作指引：

1. 開(kāi)啟 Opera 與 Harmony

1.1 打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)：依次為電腦、 Opera 主機(jī);

1.2 進(jìn)入 Window, 用戶(hù)名：Harmony， 密碼：Harmony；

1.3 雙擊桌面上的 Harmony 圖標(biāo)；

1.4 用戶(hù)名：Default 密碼：Default 2. 設(shè)置拍攝條件2.1 點(diǎn)擊“Eject” ，等待主機(jī)載物臺(tái)升起，圖標(biāo)變?yōu)椤發(fā)oad” ，放入待測(cè)細(xì)胞板或玻片，點(diǎn)擊 Load，載物臺(tái)載入樣品；

2.2 點(diǎn)擊操作流程指示區(qū)的“Setup” ，設(shè)置圖像采集條件。

2.3 設(shè)置圖像熒光/明場(chǎng)通道。

2.4 選擇要拍攝的孔與視野。

2.5 設(shè)置多層拍攝(如需要三維圖像)，注：可使用此功能尋找合適聚焦高度(Height)。

2.6 點(diǎn)擊“save”存儲(chǔ)實(shí)驗(yàn)條件，命名實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)，點(diǎn)擊“OK”，保存成功。 3. 圖像采集與圖像保存

3.1 點(diǎn)擊操作流程指示區(qū)的“Run Experiment”

3.2 (可忽略步驟) 輸入細(xì)胞板的藥物濃度或細(xì)胞類(lèi)型等信息

3.3 手動(dòng)鍵入 Plate name ，點(diǎn)擊 “Start”開(kāi)始拍攝。

3.4 拍攝完畢 tiff 格式會(huì)自動(dòng)保存在數(shù)據(jù)庫(kù) Measurement。

3.5 在圖片上點(diǎn)鼠標(biāo)右鍵，“Save Image”可保存圖片為 JPG 或 PNG 格式.

3.6 多圖顯示：在位置選擇區(qū)，鼠標(biāo)選取要顯示的孔和視野(藍(lán)色變橙色)，點(diǎn)

擊右鍵，選擇六中顯示方式的任意一種。

4.整理

退出工作站軟件，關(guān)閉電腦。整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，記錄儀器使用日志。